| |
Главная |
Выделение иммуноглобулина A (IgA)Принцип метода Выделение IgA представляет известные трудности, поскольку методы, основанные на использовании молекулярного сита или на использовании различного заряда белков, не позволяют в достаточной мере отделить IgA от IgG. Для выделения IgA приходится комбинировать несколько методов, например гель-фильтрацию, осаждение балластных белков сульфатом цинка и зональный электрофорез. Довольно часто применяют ионообменную хроматографию. Небольшие количества IgA можно получать из сыворотки методом иммуноадсорбции. В молозиве человека секреторный IgA является основным иммуноглобулином, но это не характерно для других биологических видов. Выделение IgA из сыворотки человека Материалы и оборудование. Для работы необходимы: сыворотка человека, сефадекс С-200, колонки для гель-фильтрации (длина 100 см), певикон, прибор для зонального электрофореза, сульфат декстрана и хлорид кальция для удаления липопротеидов малой плотности. Методика. Исходным материалом служит плазма, из которой были удалены фибриноген и p-липопротеиды. Этот материал фильтруют через сефадекс G-200 (на рисунке). IgA элюируется несколько раньше IgG. Вторую фракцию (см. рисунок) концентрируют и снова хроматографируют на G-200. Собирают первую фракцию (от второго разделения), рехроматографируют ее и т. д. до 5 раз. Хроматография IgA на сефадексе G-200
После хроматографии фракция 2 была рехроматографирована иа сефадексе G-200. Первая фракция этого разделения подвергалась рехроматографии на сефадексе G-200 и т. д. Вторую фракцию 2, 3, 4 и 5 разделения отбрасывают (см. рисунок выше). Первую фракцию после 5 (последнего) разделения собирают и при помощи зонального электрофореза с певиконом, в качестве носителя очищают от α2-глобулина и значительна уменьшают содержание IgG. Оценка метода и другие варианты. Выход IgA при использовании этого метода составляет 20%. Иммуноэлектрофорез не выявляет примеси IgG в препарате IgA; но при анализе по методу Ухтерлони обнаруживаются следы этого белка. В некоторых случаях в препарате содержится, помимо мономера, небольшое количество полимера IgA. Недостатком этого метода является его крайняя длительность. Кроме того, методом препаративного электрофореза получают IgA с ограниченной электрофоретической подвижностью. Препарат, отражающий электрофоретическую гетерогенность сывороточного IgA, может быть получен методом, схема которого приводится ниже. Выход составляет 9%, остаточные количества IgG удаляют при помощи иммуносорбции.
Концентрирование, очистка иа ДЭАЭ-сефадексе А-50 седиментационно-декантационным методом. Элюция при помощи ступенчатого градиента: по 2 л каждого элюента на 1 л разбухшего сефадекса. В 0,01 М фосфатном буфере с рН 8,0 с ионообменником связывается 3 г белка.
Диализ против дистиллированной воды, лиофилизации. Растворяют 3,5 г лиофилизата в 100 мл 0,02 М фосфатного буфера с рН 7,0. Доводят концентрацию белка до 3,33 г/л, затем белок осаждают этанолом в конечной концентрации 25% при —5°С 30 минут.
Фракция 3 Многократная иммуноадсорбция на бромацетилцеллюлозе, конъюгированной с анти-IgG. Из антисыворотки получают γ-глобулин осаждением Na2S04 (двукратное осаждение, 140 г/л), конъюгируют его с бромацетилцеллюлозой ↓ Неадсорбированная фракция IgA Хроматография IgA на ТЭАЭ-целлюлозе
Довольно часто IgA получают следующим методом:
Выход составляет 5—10%. Отдельные партии препарата могут быть загрязнены IgG и IgM. Известной оптимизации метода можно добиться, удалив вначале большую часть IgG при помощи хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,01 М фосфатном буфере с рН 8,0, а затем выделив IgA из фракции, элюируемой 0,08 М фосфатным буфером. Выделенный данным способом IgA содержит небольшую примесь IgM. Полученный препарат преимущественно содержит IgA в мономерной форме (7S), а также некоторое количество полимера. В небольших количествах IgA можно получать непосредственно из сыворотки методом иммуноадсорбции или из иммунных преципитатов, образованных F(аb´)2-фрагментами антител к IgA. Для получения анти-IgA-сывороток допустимо использование препаратов IgA с большим содержанием IgG. Последующей адсорбцией IgG антисыворотку можно сделать специфической только к IgA. Препарат IgA с 20% IgG получают из сыворотки по следующей методике:
Чаще всего мономерные и полимерные формы IgA получают из сыворотки больных с множественной миеломой. Вначале проводят зональный электрофорез в вероналовом буфере с рН 8,6 и ионной силой 0,05 (4°С), затем хроматографию последовательно на трех колонках с сефадексом G-200 или био-гелем А-1,5ш. В ходе фильтрации IgG отделяется от мономерного IgA. Последнюю часть пика IgA, содержащую IgG, отбрасывают. Очистку и выделение IgA из сыворотки больных с миеломой можно осуществлять осаждением сульфатом аммония (50% насыщения) с последующей многократной гель-фильтрацией на сефадексе G-200 или сефарозе 6В. Можно попытаться провести очистку комбинаций последовательных осаждений сульфатом аммония, каприловой кислотой и адсорбцией на ДЭАЭ-целлюлозе (Batch-метод). Выделение IgA из сыворотки свиньи Процесс получения IgA из сыворотки свиньи аналогичен процессу получения IgA из сыворотки человека. Вначале удаляют липопротеиды осаждением сульфатом декстрана 500. к 1 мл сыворотки добавляют 0,02 мл 10% раствора декстрана и 0,1 мл 1М СаС1г. Центрифугируют 10 минут при 10 ООО g (4°С), осадок отбрасывают, надосадочную фракцию диализируют сначала против дистиллированной воды, а затем против 0,1 М трис-HCl буфера с рН 8,0, содержащего 1 М NaCl, и хроматографируют на колонке (100 см) с сефадексом G-200 (см. рисунок). Хроматография освобожденной от липопротеидов сыворотки свиньи на сефадексе G-200
Объединяют фракции 69— 78, диализируют их против дистиллированной воды и концентрируют полиэтиленгликоля 20 000. Диализируют против 0,02 М трис-HCl-буфера с рН 7,4 и по окончании диализа хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюирование проводят ступенчатым градиентом трис-HCl-буфера с рН 7,4: 0,02, 0,05, 0,075, 0,10, 0,125, 0,15 М. IgA элюируется 0,075 и 0,1 М буфером. Его концентрируют, диализируют против 0,1 М трис-HCl-буфера с рН 8,0, содержащего 1 М NaCl, и хроматографируют на сефадексе G-200. Выделяют два пика, второй собирают и рехроматографируют на сефадексе G-200. Собирают фракции, соответствующие вершине пика, концентрируют их, диализируют против 0,05 М вероналового буфера с рН 8,6 и разделяют электрофоретически на пластинах 1 % геля агара (10х20 см). Вносят в центральную канавку 0,5мл раствора белка (5 мг) и в течение 2 часов ведут электрофорез при 4°С и напряжении 3Q В/см. После этого IgA элюируют из полоски агара шириной 1,5 см с катодной стороны. Полоску агара заливают 0,15 М NaCl, замораживают при —20°С, оттаивают, центрифугируют 10 мин при 10000. Надосадочную фракцию диализируют и концентрируют. Выделение IgA из сыворотки лошади Выявление IgA в сыворотке лошади длительное время представляло серьезные трудности. Исходным материалом для выделения IgA служит псевдоглобулиновая фракция после осаждения сульфатом аммония (40% насыщения), которую диализируют против 0,005 М фосфатного буфера с рН 6,0. В ходе ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе мономерный IgA элюируется 0,06 М фосфатным буфером с рН 7,0, полимерный — 0,15 М фосфатным буфером с рН 6,0. Выделение IgA из сыворотки бычьей, бараньей и козьей сывороток Фракционирование IgA овец и коз проводят по следующей схеме:
Выделение IgA крыс Моноклональный полимерный IgA выделяли из асцитической жидкости крыс, больных плазмоцитомой, то же касается и мономера IgA. Мономерный IgA выделяли методом гель-фильтрации на ультрогеле АсА22 и АсА34, а также хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Разделение на АсА34 обеспечивает освобождение от следов полимерного IgA и альбумина. Фракционированием на ДЭАЭ-целлюлозе выделяют IgG. IgA элюируют 0,05 М фосфатным буфером с рН 6,0, содержащим 0,3 М NaCl. Выделение секреторного IgA (S-lgA) из молозива человека Материалы и оборудование. Для работы необходимы: молозиво, 1 М уксусная кислота, ДЭАЭ-целлюлоза, КМ-целлюлоза, 0,01 М фосфатный буфер с рН 7,6, 0,1 М фосфатный буфер с рН 6,4, 0,005 М ацетатный буфер с рН 5,0, 0,5 М ацетатный буфер с рН 5,0, сефадекс G-200, хроматографические колонки (2х25 см, 3х30 см, 2,5х100 см). Методика. Собирают молозиво через 2—3 дня после родов. Центрифугируют 2 ч при 20 000 об/мин с целью удаления жира. Доводят рН 1 М уксусной кислотой до 4,6, чем вызывают выпадение казеина в осадок. После центрифугирования надосадочную фракцию (3 г белка) диализируют против 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,6 и хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе (колонка 3x30 см). Ступенчатое элюирование проводят градиентом:
Собирают фракцию, элюированную вторым буфером (0,5 г.белка), диализируют ее против 0,005 М ацетатного буфера и хроматографируют на КМ-целлюлозе (колонка 2х25 см). Элюцию ведут линейным градиентам ацетатного буфера с рН 5,0, 0,005 М —0,5 М (по 300 мл каждого буфера). Фракцию, содержащую S-IgA (поданным иммунодиффузии), концентрируют и фракционируют на см) в 0,05 М трис-HCl-буфере (рН 8,0) с 1 М NaCl. Фракцию первого пика, содержащую S-IgA, снова разделяют на сефадексе G-200, диализируют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Прочие методы выделения S-IgA из молозива человека. Известны менее трудоемкие варианты получения S-IgA из молозива человека. 1. После обеззараживания и осаждения казеииа материал диализируют против 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,0 и фракционируют на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюцию проводят линейным градиентом 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,0 и того же буфера, содержащего 0,1 М NaCl. Вторую фракцию хроматографируют на сефадексе G-200. Вначале элюируется S-IgA. Полученный препарат S-IgA электрофоретически чист. Выход составляет 5—10 мг на 1 мл молозива. 2. Молозиво смешивают с равным объемом 0,15 М NaCl к центрифугируют 1 ч при 20 000 об/мин. Средний слой диализируют против 0,01 М трис-HCl-буфера с рН 8,0 и фракционируют на ДЭАЭ-целлюлозе. Для ступенчатого элюирования применяют 0,01 М трис-HCl-буферы с рН 8,0, 0,03, 0,05, 0,1 и 2,0 М NaCl. Фракцию, элюируемую буфером с 0,1 М NaCl, концентрируют и подвергают восходящей гель-фильтрации на сефадексе G-200 (2х120 см) в 0,01 М боратном буфере с рН 8,0, содержащем 0,15 М NaCl. Нисходящую часть первого пика собирают и повторно фракционируют на сефадексе G-200. Разделение повторяют 2—3 раза, причем каждый раз собирают только нисходящую часть первого пика (см. рисунок). Получение секреторного IgA из молозива человека
Белки, элюируемые 0,1 М NaC с ДЭАЭ-целлюлозы, разделяют на сефадексе G-200 3. После обезжиривания и удаления казеина проводят осаждение сульфатом аммония (0,5 насыщения), осадок растворяют и диализуют против 0,1 М трис-HCl-буфера с рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Проводят восходящую гель-фильтрацию на сефадексе G-200. Первый пик концентрируют и подвергают восходящей гель-фильтрации на сефарозе 6 В. Второй пик содержит S-IgA. Загрязнения удаляют хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе. S-IgA элюируют градиентом 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,6 и 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,4. Выделение S-IgA из молозива кролика Выделение секреторного IgA животных проводят так же, как и S-IgA человека. Сначала молозиво обезжиривают, удаляют казеин подкислением рН, затем проводят гель-фильтрацию на сефадексе G-200 в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,8. Далее проводят ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе,. уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером с рН 7,5. Проводят элюцию ступенчатым градиентом того же буфера, содержащего 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 1,0 М NaCl (см. рисунок). Фракционирование молозива кролика иа сефадексе G-200 после обезжиривания и удаления казеина
S-IgA элюируется при концентрации NaCl 0,2 и 0,3 М. В заключение проводят гель-фильтрацию на сефарозе 4 В в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,8 для удаления высокомолекулярных мукополисахаридов. Выделение бычьего S-IgA У коров S-IgA выделяют из молозива, слюны и носовой слизи. Из молозива его выделяют после обезжиривания и удаления казеина путем хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрации на сефадексе G-200. С ионообменника S-IgA элюируется 0,05 М фосфатным буфером с рН 7,0. При гель-фильтрации он опережает IgG. После рехроматографии на сефадексе G-200 препарат S-IgA еще содержит примесь агрегированного IgG. S-IgA из слюны также выделяют хроматографией на ДЭАЭ-Целлюлозе и гель-фильтрацией на сефадексе G-200. С ионообменника S-IgA элюируют ступенчатым градиентом фосфатных буферов: 0,01 М с рН 7,4; 0,02 М с рН 7,2; 0,06 М с рН 7,0; 0,1 М с рН 6,0; 0,2 М с рН 6,0. S-IgA элюируется с 0,06 М фосфатным буфером с рН 7,0. Первую половину пика после гель-фильтрации рехроматографируют на сефадексе G-200, получают иммунохимически чистый S-IgA. Из носового секрета S-IgA получают при помощи блок-электрофореза в певиконе и гель-хроматографии на сефадексе G-200. При гель-фильтрации получают два пика: первый наряду с S-IgA содержит IgM, второй— только S-IgA. Выделение S-IgA лошади Секреторный IgA лошади ведет себя при ионообменной хроматографии и гель-фильтрации так же, как S-IgA крупного рогатого скота. Поэтому для его получения можно использовать аналогичную схему очистки. Как обычно, удаляют вначале жир и казеин, осаждают белок сульфатом аммония (0,4 насыщения), растворяют осадок, диализируют его против 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,4 и хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе. «Медленную» фракцию IgG элюируют 0,01 М фосфатным буфером с рН 7,4, секреторный IgA — 0,06 М фосфатным буфером с рН 7,0. При гель-фильтрации на сефадексе G-200 S-IgA появляется между первым пиком и 75-фракцией выше области исключения. Рехроматография на сефадексе G-200 дает чистый секреторный IgA. Выделение S-IgA из свиного молока Секреторный IgA получают из свиного молока при помощи хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 (седиментационно-декантациониый метод) и гель-фильтрации. S-IgA адсорбируется на ДЭАЭ-сефадексе в 0,1 М трис-буфере с рН 7,4; десорбция происходит в 0,4 М трис-HCl-буфере с рН 7,4. Фракции концентрируют, диализируют против 0,01 М трис-HCl-буфера с рН 7,4, центрифугируют, надосадочную фракцию разделяют на биогеле А-5т в 0,15 М NaCl. В третьем (первый большой) пике обнаруживается иммуноэлектрофоретически чистый S-IgA. Молоко с относительно высокой концентрацией IgA получают после первой недели лактации, когда содержание IgG резко падает. Помимо биогеля А-5гп, для гель-фильтрации применяют также сефадекс G-200 и сефарозу. При использовании градиента трис-HCl-буфера с рН 7,4 (0,002 М — 0,3 М) вначале выходит IgG 2 со стартовым буфером, затем—IgG 1, содержащий примесь IgG 2. В средней части градиента элюат содержит IgG 1, S-IgA и IgM. Эти компоненты могут быть разделены на сефарозе 6 В. Выделение S-IgA собаки Чистый секреторный IgA из молозива собаки получают после предварительного обезжиривания и удаления казеина методом гель-фильтрации. Разделение проводят методом последовательной восходящей элюции на сефадексе G-200 и сефарозе 4 В. Фракцию, содержащую IgA, концентрируют, затем вновь наносят на колонку сефадекса G-200. Первый пик содержит IgM и IgA, следующий — IgA. Повторная хроматография дает чистый S-IgA. Выделение S-IgA морской свинки Секреторный IgA выделяют из молока морской свинки после обезжиривания и удаления казеина методом гель-фильтрации на сефадексе G-200 или методом препаративного электрофореза в певиконе. В ходе гель-фильтрации S-IgA выходит во втором пике после IgM и перед IgG 1 и IgG 2. Выделение S-IgA кур Секреторный IgA получают из желчи после диализа против 0,1 М ацетатного буфера с рН 4,6, содержащего 2% NaCl. Слизистый преципитат отбрасывают, желчь диализируют последовательно против 0,15 М NaCl и против 0,01 М трис-HCl, рН 8,0. Затем проводят хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюцию ведут 0,01 М трис-HCl-буфером с рН 8,0 с возрастающей концентрацией NaCl (0,06 М, 0,12 М, 0,30 М, 0,50 М). Большая часть IgA элюируется с 0,30 М NaCl. Далее очистку ведут с помощью зонального электрофореза в певиконе (0,03 М трис-HCl-буфера с рН 8,0) и гель-фильтрации на сефарозе 4В. Препарат оценивают по Оухтерлони с использованием анти-α-сыворотки и антисыворотки к желчи кур. |
