Главная

• Аллергия
• Клиническая иммунология
• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Оценка данных

Обсуждение уравнений

Вышеперечисленные методы пригодны в равной степени для определения концентрации участков связывания антител и для оценки их аффинности. Получаемые в эксперименте данные измерений касаются концентрации свободного гаптена (с), концентрации связанного гаптена (b) и, следовательно, молярного соотношения связанного с антителом гаптена (r).

Взаимодействие антитела с моновалентным гаптеном представляет собой обратимую реакцию, подчиняющуюся закону действующих масс.

Константа ассоциации этой реакции рассчитывается по следующей формуле:

или с применением символов:

Ка — константа ассоциации (М^-1), b — концентрация связанного с антителами гаптена (М), с — концентрация свободного гаптена (М), N — концентрация участков связывания антител (М). Последнее уравнение может быть преобразовано в координатах Скэтчарда:

Ка может быть рассчитана, только если известна концентрация участков связывания антител. Эта предпосылка осуществима при работе с высокоочищенными AT, но не с АС или гамма-глобулиновой фракцией. Поэтому возникает необходимость в дополнительных методах (радиоиммуносорбция, количественная преципитация) или в заранее определенных результатах. Концентрацию участков связывания АТ (антитело) можно получить экстраполяцией при графической обработке данных по связыванию в соответствии с уравнением Скэтчарда. Строят график зависимости b/с от b. Кривая, полученная соединением экспериментальных точек, экстраполируется для ее пересечения с осью абсцисс.

Оценка результатов связывания при определении аффинности

Слева: определение концентрации участков связывания антител (N) путем распределения данных измерений в соответствии с уравнением Скэтчарда и экстраполяция до абсциссы.
Справа: оценка одинаковых данных по связыванию при помощи уравнения Сипса.
Представлены два различных по аффинности препарата анти-ДНФ-антител кролика;
(1) Ко=5,6Х10⁵ М^-1, а=0,8, N=10,6X10^-6 М;
(2) Ко=4,9Х10⁶ М^-1, а=0,7, N=5,6X10^-6 М.

 Точка пересечения кривой и оси абсцисс соответствует N при теоретически бесконечно высокой концентрации гаптена и полном насыщении антител.

Уравнение может быть преобразовано в следующее уравнение:

Для построения графика этого уравнения 1/b наносится по отношению к 1/с, экстраполяцию проводят до их слияния при бесконечно высокой концентрации гаптена.

Значение N может быть получено графически. Этот процесс имеет смысл только в том случае, когда используются высокие концентрации гаптена, приводящие к максимальному насыщению в экспериментальных условиях, в противном случае ошибка при экстраполяции становится недопустимо большой. Приведение данных связывания различных систем AT—Г при помощи уравнения Скэтчарда к графическому виду наглядно показывает, что линейная зависимость характерна только для гомогенных антител. Суммарные препараты антител к гаптену всегда дают более или менее изогнутую кривую. Такой вид графика обусловлен гетерогенностью антител по аффинности. В этих условиях невозможно получить репрезентативную константу ассоциации. Наиболее точно можно судить о ней по уравнению Сипса. При помощи этого уравнения можно вычислить среднюю константу ассоциации (Ко), которая больше соответствует распределению антител по их аффинности. Уравнение Сипса основано на предпосылке, что значения аффинности распределяются равномерно и симметрично:

Для практических целей лучше использовать логарифмическую форму уравнения Сипса:

Ко — истинная средняя константа ассоциации (М^-1), а — индекс гетерогенности (0<а<1).

Значение индекса, равное 1, соответствует гомогенной по аффинности популяции антител. Уменьшающиеся значения а указывают на все большее отклонение Ка определенных популяций антител от средней константы ассоциации (Ко). Строят график зависимости log (b/N—b) от log с. По одной точке измерения можно построить уравнение прямой по методу наименьших квадратов. Индекс гетерогенности а соответствует при этом наклону прямой. Истинная средняя константа ассоциации (так же, как и Ка) по определению равна обратной величине концентрации свободного гаптена (с) при условии, что половина связей антител занята молекулами гаптена. Теоретические соображения и вариабельность экспериментальных данных часто вызывали критику определения Ко при помощи уравнения Сипса. Причина этих отклонений — несоответствие реально существующего в природе распределения антител по аффинности равномерному и симметричному распределению, принятому Сипсом. Были описаны сложные математические методы решения, берущие за основу непредетерминированное и предетерминированное распределение значений аффинности. К тому же при работе этими методами требуются такие затраты реактивов (увеличение b и с) и времени подсчета данных, что их ценность для рутинной работы утрачивается.

Определение валентности антител

При наличии очищенных специфических антител становится возможным соотнести в молях количество связанного гаптена с количеством антител. Молярное соотношение Г/АТ=(r) Заменяет b в предидущих уравнениях. Крайние значения r, наблюдаемые при полном насыщении участков связывания антител гаптеном соответствуют валентности N-антител. Уравнение Скэтчарда применительно к данному случаю выглядит следующим образом:

Для определения средней истинной константы ассоциации (Ко) можно использовать уравнение Сипса в следующей форме:

Расчет термодинамических величин констант ассоциации

Значение константы ассоциации делает возможным расчет свободной энергии по формуле:

где R — универсальная газовая постоянная, Т — абсолютная температура.

Определив Ко для двух различных температур, можно определить энтальпию Н° по формуле, преобразовав ее

в уравнение:

Величину энтропии ΔS° определяют по формуле:

ΔG° = ΔН° — TΔS°.